代谢组学技术及其在临床研究中的应用
李灏, 姜颖, 贺福初
蛋白质组学国家重点实验室, 北京蛋白质组研究中心, 北京放射医学研究所, 北京 102206
摘要：在后基因组时代，系统生物学研究成为人们关注的焦点。转录组学、蛋白质组学等功能基因组学研究方法可同时检测药物或其它因素影响下大量基因或蛋白质的表达变化情况，但这些变化不能与生物学功能的变化建立直接联系。代谢组学方法则可为代谢物含量变化与生物表型变化建立直接相关性。代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量，进行全面代谢物分析需要分析化学技术的支撑，核磁共振和基于质谱的分析技术是代谢组学研究的两种主要技术手段。代谢组学研究可产生大量数据信息，对这些数据进行分析离不开化学统计学的应用，比如主成分分析、多维缩放、各种聚类分析技术以及功能差异分析等。本文综述了近年来代谢组学分析技术及数据分析技术的研究进展，在此基础上，对代谢组学在临床研究及临床前研究中的应用研究进展进行了综述。对疾病代谢表型图谱的研究有助于人们了解疾病发生、发展以及致死的机制；在临床条件下，这些代谢图谱可以作为疾病诊断、预后以及治疗的评判标准。代谢物组成的变化是毒物胁迫对机体造成的最终影响，利用代谢组技术可以直接反映毒物对机体的影响。质谱技术、NMR技术的应用使得药物筛选过程可以快速完成，并有助于实现个性化用药。此外，利用代谢组技术还可以进行已知酶的新活性研究，也可以研究未知酶。
关键词：代谢组学; 核磁共振; 质谱; 化学统计学; 临床应用; 临床前应用
Metabonomics approaches and its roles in clinical research
LI Hao, JIANG Ying, HE Fu-Chu
State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 102206, China
Abstract: In the post-genome era, systems biology research is a main focus. Functional genomics such as transcri-tomics and proteomics can simultaneous determine massive gene or protein expression changes between subjects, or following drug treatment or other intervention. However, these methods do not provide direct information about how a change in mRNA or protein is coupled to a change in biological function. As a result, metabonomics and its many pseudonyms (metabolomics, metabolic profiling, etc.) have exploded onto the scientific scene in the past several years. Metabonomics is a rapidly growing area of scientific research and is a systems approach for comprehensive and quantitative analyzing of all the metabolites in a biological matrix. Comprehensive metabonomics investigations are primarily a challenge for analytical chemistry. Fundamentally, there are two types of metabonomics approaches: mass-spectrometry (MS) based and nuclear magnetic resonance (NMR) methodologies. Metabonomics measurements provide a wealth of information and interpretation of these data relies mainly on chemometrics approaches to large-scale data analysis and data visualization, such as principal and independent component analysis, multidimensional scaling, a variety of clustering techniques, and discriminant function analysis, among many others. In this review, the background to the approach known as metabonomics is provided, summarizing the analytical and statistical techniques used. Some of the major applications of metabonomics relevant to clinical and preclinical study are then reviewed. The applications of metabonomics in study of liver diseases, cancers and other diseases have proved useful both as an experimental tool for pathogenesis mechanism research and ultimately as a tool for diagnosis and monitoring treatment response of these diseases. Next, the applications of metabonomics in preclinical toxicology, in which this technology is having and will continue to have significant impact, are discussed, then the role that metabonomics might have in pharmaceutical research & development is explained with special reference to the aims and achievements of the Consortium for Metabonomic Toxicology (COMET), and the concept of pharmacometabonomics as a way of predicting an individual’s response to treatment is highlighted. Finally, the role of metabonomics in elucidation the function of the unknown and the novel enzyme is mentioned.
Key words: metabonomics; nuclear magnetic resonance (NMR); mass-spectrometry (MS); chemometrics; clinical applications; preclinical applications
《遗传》2008年第4期即将发表。
在后基因组时代，系统生物学研究逐渐成为人们关注的焦点。系统生物学研究的目的是根据细胞内基因、蛋白质、代谢物以及细胞器等组分间的时空相互关系构建生物网络了解生物行为[1,2]。一些组学研究技术的发展极大推动了系统生物学的研究，比如转录组学、蛋白质组学等功能基因组学研究方法可同时检测药物、疾病、环境或其它因素影响下大量基因或蛋白质的表达变化情况，但这些变化不能与生物学功能的变化建立直接联系。代谢组学方法则可为代谢物含量变化与生物表型变化建立直接相关性[3]。
实际上，代谢组学的出现甚至早于转录组、蛋白质组等其它组学，早在利用核磁共振（nuclear magnetic resonance , NMR）对体液中的多种代谢物进行研究，并利用多变量统计学方法对产生的复杂数据进行分析时，代谢组学（metabonomics）的概念就产生了[4]。与此同时，主要源于植物组织和动物体外的类似研究导致了另一代谢组学（metabolomics）概念的产生[5]，用于两种概念的研究方法大体一致。
代谢组（metabolome）是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合，包含一系列不同化学型的分子，比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等[5,6]。代谢组学来源于代谢组一词，是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态，协助阐释新基因或未知功能基因的功能[7~9]，并且可以揭示生物各代谢网络间的关联性，帮助人们更系统地认识生物体[7]。
近年来，代谢组学研究越来越得到人们重视。进行代谢组学研究涉及生命科学、分析科学以及化学统计学三大方面的专业知识，代谢物化学分析技术及数据分析技术的进步极大促进了诸多生物、医学问题的研究，这些知识的综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极为重要的作用[3,10~12]。本文综述了近年来代谢组学分析技术及数据分析技术的研究进展，在此基础上，对代谢组学在临床研究及临床前研究中的应用研究进展进行了综述。
1 代谢组分析实验设计及样品制备
在进行代谢组分析前，研究者首先应明确自己的研究目的。代谢组学技术对于研究变化或遗传修饰引起的所有代谢物变化过程是很有效的，比如寻找疾病生物标志物用于早一种大规模研究，对于研究机体对外源性物质（药物或毒物）刺激、环境期诊断。但对于研究特定种类的代谢物，这种大规模研究平台的灵敏度则不如传统的技术手段，比如通过固相萃取浓缩目的代谢物进行研究。
明确研究目标后，研究人员进入实验设计步骤。为最大程度的保证数据数据准确性以及数据信息的丰富性，研究人员应尽量采用统计实验设计方法（statistical experiment design, SED），这能通过最少的实验次数获得最大量的数据信息。比如Antti等[13]利用SED设计了肼的剂量以及作用时间毒性效应实验，通过NMR及偏最小二乘法（partial least squares, PLS）分别揭示了剂量、作用时间对毒性的影响以及二者的关联。
进行实验设计后，研究者即可开始进行代谢组分析，首先需要进行样品的提取。对于组织和细胞培养液，水相和有机相代谢物可以很容易地被提取。实际上，不论各种代谢物在体内参与何种代谢过程，通过酸和无机溶液抽提程序，所有的胞浆以及膜代谢物均会被提取出来[14]。Dumas等[15]评估了利用1H-NMR采集人尿液代谢组数据的重复性，由于样品制备过程的不一致性导致结果重复性较差。因此，为最大程度减小操作对代谢组数据产出的影响，人们应严格遵循一套标准的提取程序（Standard Operating Protocols, SOPs）。由于高氨酸可迅速灭活代谢活性，并可通过钾沉淀去除，曾被用于提取脑代谢物。但酸提取增加了样品的盐离子浓度，而且高氨酸会氧化提取的代谢物。目前常用的一种替代方法是利用水和乙腈混合液提取水相，但这种混合溶液也存在灭活代谢活性速度较慢的问题。
2 代谢组学研究分析技术
与相对成熟的转录组、蛋白质组研究类似，新生的代谢组学领域研究目标在于对细胞、组织以及体液进行整体性分析[7]。将小分子代谢物图谱与转录本、蛋白质表达图谱进行整合，研究者希望辨别与疾病等相关的特异性代谢物和代谢途径。在进行代谢组整体分析时，研究者在许多方面面临一系列问题，这些问题超过了进行转录组和蛋白质组研究所面临的困难。比如，代谢物与遗传密码之间没有直接联系，代谢物是细胞或组织中许多酶反应网络的催化产物。类似地，代谢物不是性状清楚的单体的线性多聚体，而是具有不同化学和物理特性的结构多样的分子组合。基于上述特点，代谢组研究需要比较复杂的分离、鉴定方法，到目前为止，应用的方法主要包括核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）[16]、电喷雾电离质谱（electrosprary ionization mass spectrometry, ESI-MS）[17]、液相色谱-紫外光谱-质谱联用（liquid chromatography ultraviolet mass spectrometry, LC-UV-MS）[18]、串联质谱（tandem mass spectrometry, tandem MS）[19]以及液相色谱-质谱联用（liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS）[20~22]等。NMR可以快速、无损伤性地进行代谢物的体内（in vivo）[23]或体外（in vitro）[24]比较分析。采用何种分析技术主要取决于待分析生物系统的种类以及解决何种科学问题[12]。直接应用MS进行代谢物分析虽然速度也较快[17]，但具有灵敏度以及分辨率较低的缺点。将MS与气相色谱（gas chromatography, GC）或LC联用（GC-MS或LC-MS），虽然降低了分析速度，但却提高了分析灵敏度以及分辨率。而且基于质谱的分析技术已长期用于代谢物指纹图谱分析，具有比较成熟的样品制备、数据采集以及分析等操作程序[7]。近来，两种新质谱技术傅立叶变换回旋共振质谱(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, FTICR-MS)和毛细管电泳质谱（capillary electrophoresis mass spectrometry, CE-MS）被用于代谢物图谱分析。FTICR-MS具有高通量的优点，可检测上千种代谢物[25]，但不能区分异构体限制了它的应用；CE-MS检测灵敏度较高，可以检测低丰度代谢物，Soga等[26]利用CE-MS在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中检测到一千多种代谢物。NMR的灵敏度以及分辨率较低，无法检测复杂样品中丰度较低的代谢物，但是利用NMR可以确定代谢物的结构[27]，并且具有无损伤性检测的优点，使得NMR在哺乳动物代谢物检测中优于质谱技术，其中最具代表性的工作是Nicholson研究小组[28]利用NMR通过研究人血清代谢物评估冠状心脏疾病（coronary heart disease）。
利用1H NMR可以从组织或细胞中获得高通量的代谢组数据，然而并不能获得全部代谢物的信息，部分代谢物信息会损失掉[29]。近年来，研究者对NMR技术做了许多改进，比如利用低温降低仪器的热噪音，提高样品信号对噪音的比值[4,30]；利用双向核磁共振（two-dimensional NMR, 2-D NMR）提高样品信号识别效率[4]。此外，利用魔角旋转核磁共振（1H magic-angle spinning nuclear magnetic resonance, 1H MAS NMR）可以克服1H NMR的缺点，从组织获得较全面的高通量代谢物信息[31]。
值得注意的是，尽管代谢组学研究的最终目标是无偏性的检测细胞、组织或器官中的全部代谢物，但目前所有的分析技术距离这一目标都还很遥远[32]。
3 数据采集与分析
3.1 数据采集
与转录组、蛋白质组研究一样，代谢物可以通过与对照样品的比值进行相对定量，但这种定量方法不能进行不同样品间量的比较。通过添加标准参照物以及对代谢物进行同位素标记，可以获得绝对定量的代谢组数据集[7]。此外，数据采集的重复性以及采用何种数据处理方法对代谢组分析结果的影响很大[33]。
不同样品的同一个变量应具有相同的特征与含义，因此NMR产生的峰漂移的差异会影响数据的分析[12]。人们采用不同的方法解决这个问题，比如，应用1H-NMR分析体液代谢物化学位移的可变性促进了峰存储、排列方法的发展。一个常用的方法是将光谱区域内的信号进行整合存储，或者对峰进行自动识别排列。Stoyanova等[34]利用PCA消除了位置噪音，Forshed等[35]应用基因算法确定错误排列的NMR光谱。
3.2 数据分析
一旦获得代谢组的定量数据集，可以采用已在转录组、蛋白质组分析中得到应用的多种数据分析策略进行代谢组数据分析[32]，这些分析策略的基本原则是比较实验组与对照组之间代谢物水平差异，并利用统计方法评估这些差异的显著性。利用这些分析方法即可以研究某些代谢物在不同样品间的表达相关性[36]，并利用这些相关性构建相互关系网络[37]；也可以对整体代谢物进行分组研究。
代谢组数据的分析离不开化学统计学的应用。广义上，化学统计学是一种应用数学和统计方法进行化学研究的方法[38]，在利用NMR和MS进行的代谢组学研究中，化学统计学是指利用数学或统计工具进行光谱处理、峰比对、异常值检测以及数据均一化等[39]。基于预测方法的多变量分析是分析代谢组研究产出的复杂数据的一种有效方法，其中主成分分析（principal-component analysis, PCA）是一种将原始特征压缩至最小可能性成分数的维数缩减方法，即用较少的综合性变量代替原来众多的相关性变量，使有关的研究简化[4,10,12,40]。PCA已成为代谢组研究中最常规的分析方法，在这方面有许多应用实例，比如Akira等[41]利用PCA研究高血压引起的大鼠尿液代谢物变化。PCA可以对代谢组数据进行总体分析，进而区别实验组与对照组，也可以进行代谢物聚类、检测异常的代谢物。
然而，较为简单的PCA分析有时并不能得到令人满意的结果，因此需要开发一些更为复杂的较高级的数据分析方法。其中，一种已被应用的监督方法是偏最小二乘法（partial least squares, PLS），比如Wang等[42]利用LC-MS和PLS不仅可区分开II型糖尿病与对照组，还鉴定到一些潜在的诊断生物标志物。PLS方法中描述性的数据矩阵X（比如光谱测量值、微阵列芯片信号强度）可以被响应数据矩阵Y（比如毒性测量值、样品重复信息）所提供的信息识别[4,12]。然而，数据矩阵X中与数据矩阵Y不相关的系统变量可影响PLS分析模型，这将使得矩阵X、Y中的某些正相关被忽略。正交偏最小二乘法方法（orthogonal-PLS, OPLS）是一种新近发展起来的将正交信号校正方法（orthogonal signal correction, OSC）与PLS进行结合对PLS进行修正的分析方法。OSC最早是一种用于分析光谱数据的方法， 它的原理就是与一个给定的问题正交（不相关）的结构性变异可以被鉴定、研究，进而被舍弃。
OPLS是一种类似于PLS的多变量预测监督方法，但其整合了OSC作为滤噪技术对PLS方法进行了改进[43]。根据数据矩阵Y的差异，OPLS将数据矩阵X的差异分为两个部分，第一部分代表与Y相关的差异，第二部分代表与Y不相关（正交垂直）的差异，OPLS可将这两部分差异进行区分。OPLS是PLS的一种扩展并与PLS具有相同的分析目标，而且OPLS可直接与建模结合，近年来OPLS也得到了一些应用，比如Stella等[44]利用OPLS对低肉饮食与蔬菜饮食对代谢造成的影响进行了鉴定。O2PLS是一种泛化的OPLS，可在两个数据矩阵中进行双向建模和预测。
此外，独立成分分析（independent component analysis）[45]、正则相关系数（canonical correlation）、对比分析（correspondence analysis）、神经网络（neural networks）、贝叶斯模型（Bayesian modeling）以及隐含马尔可夫模型（hidden Markov models）等也是代谢组分析中常用到的模型分析方法。这些方法都是建立于代谢物间互相依赖的基础上的，例如以协变量或相互关系矩阵形式呈现的代谢物浓度间的关系[9]。实际上，代谢组学数据分析的一个显著特征是当重复进行测定时，一小批意义重大的代谢物浓度高度相关[46]，代谢物浓度之间的这种相互依赖关系并不存在于转录本与蛋白质之间[47]）。
4 代谢组学的应用
进行代谢组学研究涉及生命科学、分析科学以及化学统计学三方面的专业知识，这些知识的综合运用促进了诸多生物、医学问题的研究，使得代谢组研究在疾病诊断、药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极为重要的作用[3,10~12]。
4.1 代谢组学在肝病研究中的应用
代谢组研究的一个重要部分是比较分析健康状态与疾病状态下小分子代谢物表达的差异，这有助于人们寻找各种疾病早期诊断的生物标志物，并可用于疾病预后及治疗效果的评判[6]。肝脏是机体内负责能量合成和物质代谢的中心器官，各种肝脏疾病严重威胁人类健康，对肝病进行研究很有必要，代谢组技术为肝病的诊断、机制研究等提供了一个比较好的技术平台。Yang等[48]利用LC-MS和偏最小二乘法差异分析法（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）鉴定到5个慢性乙型肝炎引发的急性肝衰的诊断标志物，其中羟鹅脱氧胆酸（glycochenodeoxycholic acid, GCDCA）是传统标志物，而另外4个则是新鉴定到的诊断标志物。醋氨酚（acetaminophen, AAP）是一种广泛应用的止痛剂，但过量AAP易引发严重肝炎，Soga等[49]利用毛细管电泳-电喷雾电离飞行时间质谱联用（capillary electrophoresis with electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry, CE-TOFMS）研究表明小鼠血清视晶酸（ophthalmic acid）可以指示AAP作用下谷胱甘肽（glutathione, GSH）的损耗，视晶酸可能是肝细胞受到氧化胁迫时一种新的生物标志物，可用于氧化损伤的早期预测。因此，视晶酸也有利于研究氧化损伤起重要作用的疾病，比如帕金森病（Parkinsons）、阿耳茨海默氏病（Alzhimers）、心肌梗塞以及糖尿病等[50]。半乳糖胺（galactosamine, galN）是一种经典的肝毒素，已被广泛的用于肝损伤实验研究中[51]。Feng等[52]用galN结合脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）造成BALB/c小鼠突发性肝损伤（fulminant hepatic failure, FHF），然后利用气相色谱-飞行时间质谱联用技术（gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry, GC/TOFMS）和PCA对FHF的代谢图谱进行了研究，结果表明血浆中的5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxylindoleacetic acid）、β-羟基丁酸（β-hydroxybutyrate）以及磷酸盐的浓度变化可作为FHF的早期诊断标志物。Coen等[53]则利用NMR、主成分分析方法（principal components analysis, PCA）和OPLS方法研究了galN以及毒性保护剂甘氨酸对大鼠肝、血、尿代谢造成的影响，结果产生了一些意想不到的发现，甘氨酸保护肝脏免受galN毒性的机制与尿核苷酸库有关，甘氨酸促进了肝脏尿核苷酸水平，用以对抗galN造成的尿核苷酸耗竭，使得galN得到充分代谢。
4.2 代谢组学在肿瘤研究中的应用
在某些国家，癌症已经取代心脏疾病成为死亡率第一的疾病[54]，肿瘤研究已经越来越受到人们重视。NMR和MS技术是在研究肿瘤代谢图谱中应用不断得到增强的两项关键技术[14]。利用NMR和MS研究肿瘤引起的代谢变化不是一个新的研究课题，它甚至早于代谢组学（metabolomics或metabonomics）概念的提出[28]，比如Jellum等早在1981年就利用GC-MS对正常脑组织、垂体瘤组织以及脑瘤组织代谢物进行了比较研究。然而，代谢组学概念的提出使得这类研究具有了整体研究思路，即研究肿瘤发生对细胞、组织或器官中所有小分子代谢的影响。近来的研究表明，不同肿瘤制备样品（比如培养细胞、组织切片、体内肿瘤块等）的代谢图谱与肿瘤类型、增殖、代谢活性以及细胞死亡有较强的相关性。对肿瘤代谢表型图谱的研究有助于人们了解肿瘤发生、发展以及致死的机制[55]；在临床条件下，这些代谢图谱可以作为肿瘤诊断、预后以及治疗的评判标准[14,56]。人们利用NMR、MS已对多种肿瘤进行了代谢组研究，这些研究有助于揭示肿瘤增殖与代谢的联系。Yang等[57]利用1H MAS NMR和PCA研究表明人轻度肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）及重度肝癌与毗邻的正常肝组织在代谢物表达上有显著差异，且轻度肝癌与重度肝癌之间也有显著差异，这对于肝癌的早期诊断很重要。肿瘤动物模型的应用也极大促进了肿瘤代谢组学研究的发展[14]，比如Morvan等[58]利用2-D 1H MAS NMR研究了抗癌药物氯乙基亚硝脲类（chloroethylnitrosourea, CENU）对黑色素瘤和肺癌小鼠代谢物的影响，结果表明CENU对能量代谢、DNA修复等代谢途径产生影响。此外，代谢组技术已应用于脑瘤[59]、前列腺癌[43,60]、乳腺癌[61]、卵巢癌[62]等引发的代谢物变化的体内检测。
4.3 代谢组学在其它疾病研究中的应用
NMR应用于临床疾病研究已有多年[10]，但此时的NMR研究与严格意义上的代谢组研究仍有差别，Lindon等[63]报道了Foxall研究组和Le Moyec研究组利用代谢组技术研究肾移植的工作，这被看做是传统临床NMR研究向临床代谢组研究转变的开始。由于代谢组学研究技术具有其它组学技术所不具备的一些特点，比如通过代谢物变化直接反映疾病对机体的影响，因此近年来代谢组技术在疾病诊断、机制及治疗等方面中的研究越来越受到人们的重视[64]。除在肝病、肿瘤等方面的应用外，该技术在其它疾病研究领域也得到应用，比如Paige等[65]利用GC-MS研究表明，老年抑郁症可能与脂类、神经递质等的代谢改变有关；Weljie等[66]利用1H NMR对转基因风湿性关节炎小鼠进行了研究。此外，在肾病[67]、高血压[41]、II型糖尿病[68~70]、心血管病[71,72]、炎症性肠病[73]、哮喘[74]、脑膜炎[75]以及精神分裂症[76]等多种疾病研究中，代谢组技术也已得到广泛应用。除在疾病诊断中发挥作用外，代谢组学技术也已被用于机体健康状况的评价，特别是营养水平对健康的影响[10,77,78]。
4.4 代谢组学在毒理学中的应用
在毒理学研究中，评判组织损伤的“金标准”是进行组织病理学检测，这种检测并不提示分子方面的信息。此外，由于组织病理学检测往往依赖于病理检测人员的经验，这种检测具有一定的主观性，可提供定性信息，而不能提供定量信息。代谢物组成的变化是毒物胁迫对机体造成的最终影响[79]，利用代谢组技术可以直接反映毒物对机体的影响。它莫西林（tamoxifen, TMX）是一种常用的抗乳腺癌药物，可引发非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH），Lelliott等[80]利用NMR与转录组技术相结合进行研究，结果表明TMX作用通过降低脂肪酸合成酶（fatty acid synthase, FAS）的表达及活性严重影响了肝脏内脂肪代谢，为NASH的形成及相关代谢紊乱提供了一种新的解释。代谢物组成的改变可以直接或间接地反映在流经受损器官地血液中，进而经过肾脏过滤后，这种改变还可反映在尿液中。采集机体尿液或血液，利用代谢组技术分析毒物作用后代谢物组成变化，可以无损伤性的评估目标器官的受损程度[79]。Robertson等[81]利用NMR以及PCA研究了两种肝毒剂四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）、α-萘异硫氰酸（α-naphthylisothiocyanate, ANIT）和两种肾毒剂2-溴乙胺（2-bromoethylamine, BEA）、对氨基苯酚（4-aminoohenol, PAP）对Wistar大鼠尿液代谢物组成的影响，结果表明利用代谢组技术可以快速进行毒剂的体内检测。
4.5 代谢组学在药物研发中的应用
在药物研发过程中，确定候选药物的药物代谢动力学、代谢特性以及毒副作用等是必需的，药物代谢物质的检测、鉴定以及表达分析已经成为药物研发的首要任务[4,21]。传统的药物代谢物质检测、鉴定过程比较耗时费力，质谱技术、NMR技术的应用使得这一过程可以快速完成，并能鉴定低丰度的药物代谢物质。早在1980年代，人们就利用1H NMR研究药物的毒副效应，Plumb等[82]也利用LC-MS对候选药物进行了筛选。近年来人们开始将NMR与LC-MS结合用于这方面研究，比如Lenz等[83]对肾毒素庆大霉素（gentamycin）进行的研究。对候选药物进行大规模筛选需要多家机构进行科研合作，在这方面， 5家大制药公司和伦敦帝国学院（Imperial College London）发起成立了毒物代谢组联盟（Consortium for Metabonomic Toxicology, COMET）计划，该联盟开发新的代谢组数据采集、分析方法，利用1H NMR对大鼠和小鼠尿液、血清进行代谢物分析，对候选药物进行临床前毒副效应进行研究[84]。COMET可以评估分析仪器以及生物体的差异对结果的影响，提高结果的可重复性[85]，其最终目的在于建立药物毒副作用的专家预测系统，并对种属间药物毒性差异进行研究[86]。
药物基因组学（pharmacogenomic）研究的一个长期目标是了解遗传差异（基因多态性）导致不同个体间药物代谢能力的差异，以及药物在不同个体间作用效果及副作用的差异，从而实现根据个体情况进行个体化用药[87]。新近出现的药物代谢组学（pharmacometabonomics）也能帮助人们了解不同个体对药物作用反应的差异[88]，这种研究方法对遗传差异和环境影响都很敏感，通过对代谢物变化进行分析能很好的揭示这些差异。
4.6 代谢组在酶功能研究中的应用
阐释真核生物以及原核生物基因组编码的数量众多的各种酶的功能是21世纪人们面对的一个重大课题。利用RNAi[89]、基因敲除[90]等遗传策略结合细胞、生物体表型分析，可以有效分析酶在（生理）病理条件下的功能。然而，这些策略不能用于进行内源性酶生化功能的整体分析。此外，由于体内存在蛋白质相互作用网络、蛋白质翻译后修饰以及人们目前对酶与底物相互关系认识不足等原因，传统的体外酶功能研究方法也不适用于体内酶功能整体分析[6]。代谢组学研究方法可以克服上述这些困难，对代谢网络中的酶功能进行有效的整体性分析[91]。
酶通过催化特异底物生成产物调节生物变化过程，鉴定内源性底物可推知体内酶的功能。利用代谢组技术研究酶功能有两种策略：代谢物指纹印迹分析以及代谢物发掘，通过这些策略可以进行已知酶的新活性研究，也可以研究未知酶，比如Chiang等[92]研究了癌细胞中未知功能酶KIAA1363在醚类信号传导途径中的调控作用。利用代谢物指纹印迹分析酶功能的先驱工作是由Allen等[17]做出的，他们利用NMR以及MS快速鉴定了酵母中某些特异性酶缺失突变后代谢物的整体变化，结果表明，基于相同的代谢物表达图谱，酵母中的酶可被分为不同的功能亚族。但正如前文所述，这两种分析方法虽然分析速度较快，但灵敏度以及分辨率较低，无法检测复杂样品中丰度较低的代谢物。Saghatelian等[22]利用LC-MS在一定程度上提高了代谢物分析的灵敏度和分辨率，使得酶功能研究更为深入。他们利用代谢物发掘图谱方法（discovery metabolite profiling, DMP）比较分析野生小鼠与缺乏脂肪酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase, FAAH）小鼠的脑代谢物图谱差异，鉴定到大量FAAH的内源性底物，包含中枢神经系统（central nervous system, CNS）富集的N-乙酰牛磺酸（N-acyl taurines, NATs），尽管目前对NATs在CNS中的功能仍不是很清楚，但这些结果仍表明FAAH促进这类信号分子的体内表达。
5 结语和展望
与其它所有技术一样，代谢组学技术并不能解决所有问题，但能为生物学多个领域的研究提供有用信息[10]。代谢组学研究使得代谢物含量变化与生物表型变化建立直接相关性，极大促进了后基因组学时代功能基因组研究的发展。然而，代谢组研究目前仍处于起步阶段[3]，仍有许多问题亟待人们去解决。就研究对象而言，人们已经开始从较为简单的研究个体向较为复杂的研究对象转变。比如，Goodacre等[93]将人体看做是人体自身与体内共生微生物构成的超级生物体，从而对这个超级生物体进行代谢组学研究，这将有助于评估共生微生物对人类健康的影响，并有助于评估共生微生物在疾病条件下对机体的影响。
代谢组学研究的目的是定量分析一个细胞、组织或器官内所有代谢物的含量，化学分析技术和数据分析技术对于代谢组研究是必需的。尽管化学分析分析技术与数据分析技术都取得了长足进展，但这些技术仍需要进一步发展以满足研究需要。比如，尽管代谢组学研究的最终目标是无偏性的检测细胞、组织或器官中的全部代谢物，但目前所有的化学分析技术距离这一目标都还很遥远[32]。再比如，如前文所述，较为简单的PCA分析有时并不能得到令人满意的结果。然而，在多数进行代谢组学研究发表的论文中，PCA仍是最主要的数据分析方法，尽管PLS、OPLS等较为复杂的分析方法可以使人们获得更多的信息，但目前这些方法的应用仍远低于PCA的应用[12]。
此外，代谢组学的单独应用并不足以解决大量的生物问题。实际上，任何一种组学研究平台的单独使用都只能为系统生物学研究提供有限的认知。不同的实验技术手段都只能测定同一生物体系的不同侧面，而且测定的深度和广度均有所不同。此外，各种高通量分析技术的假阳性率和假阴性率均较高，并且每种技术均有不同程度的系统偏性[2]。因此人们有必要对研究对象进行各种组学的平行研究，并将这些高通量的组学数据进行整合，充分挖掘包含在这些数据中的生物意义。这种整合对于系统生物学研究是必需地，有助于降低整体数据的维度从而使人们获得感兴趣的系统有用信息。人们已对诸如酵母[94]、植物[95,96]以及哺乳动物[97,98]等细胞以及复杂系统进行了大量平行组学技术平台的研究。对这些生物体的不同分子水平进行组学研究并将这些数据进行整合，阐释它们之间彼此的相关性有助于人们寻找特异且可信赖的疾病诊断等各种生物标志物。例如，将蛋白质组学数据与代谢组学数据进行整合，生物代谢的终点（代谢物）有助于验证基于蛋白质组学研究提出的假设。
总之，随着代谢组学研究技术的不断进步，其在临床及前临床中的应用也将更为广泛和深入，必将促进更多生物、医学问题的解决。
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2008年1月17日
