新型定点重组酶系统在植物基因转化和基因叠加中的应用前景蒙古马遗传多样性研究进展
周银1，王跃驹2，王瑛1
1．中国科学院武汉植物园，武汉 430074；
2．Department of Pediatrics, Weill Medical College of Cornell University, New York, NY 10021, USA
摘要: 定点重组转基因技术是调节外源基因表达，提高转基因效率的重要手段之一。核苷酸的重组反应介导基因之间的易位、倒位、删除和整合，从而影响基因在不同组织器官和不同发育阶段的表达。将位点特异性重组系统应用在转基因技术中，不仅可以用来在短时间内获得大量结构正常，表达稳定的转化植株，提供育种新资源，还可用于高效鉴定新基因的功能。基于定点重组的基因叠加技术使转基因作物向复合型性状聚合体的方向发展，加快了新品系的研发进程，将为我国转基因作物的研发提供新的技术思路。
关键词: 转基因；定点重组；基因叠加
Application prospect of new site-specific recombination systems in gene transformation and gene stacking
ZHOU Yin1, WANG Yue-Ju2, WANG Ying1
1． Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430074, China
2． Department of Pediatrics, Weill Medical College of Cornell University, New York, NY 10021, USA
Abstract: Site-specific recombination technology provides an important means for regulating transgene expression and improving efficiency of gene transformation. This technique can lead to the translocation, inversion, deletion, and integration, and the expression of the affected genes can be manipulated in different tissues and organs at different developmental periods. Using site-specific recombination system in gene transformation, we can not only acquire plenty of transformants with precise structural fidelity and faithful expression, but also understand the function of new genes efficiently. Gene stacking technology based on the site-specific recombination can produce transgenic crops with good complex traits, which will accelerate the process of research and development of elite cultivars and provide technical support for the exploration of transgenic crops in China.
Keywords: transgene; site-specific recombination; gene stacking
收稿日期：2007-08-09; 修回日期：2007-09-06
基金项目：国家自然科学基金（30570172）、武汉市晨光项目（20045006071-34）和中国科学院百人计划项目资助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (30570172), Wuhan Chenguang Project (20045006071-34) and 100 Talents Program of Chinese Academy of Sciences]
作者简介：周银（1983-），女，湖北人，硕士研究生，专业方向：植物学。Tel: 027-87510024；E-mail: ripplet0931@163.com；
共同第一作者：王跃驹（1972-），男，山东人，博士，研究方向：分子技术和分子生物学。Tel: 212-746-3955；E-mail: kew2010@med.cornell.edu
通讯作者：王瑛（1973-），女，山东人，博士，研究员，研究方向：植物分子遗传学和比较功能基因组学。Tel: 027-87510675；E-mail: yingwang@wbgcas.cn
1 转基因技术发展的现状
转基因技术是将外源基因导入到生物体基因组中，其目标是利用优良基因进行遗传改良，从而获得人们所需要的高产优质的品种[1]。目前，随着转基因技术的日臻完善，许多转基因作物已投入大田生产，如：棉花、玉米、油菜、大豆、小麦等。自1996年开始实现商业种植以来，全球转基因作物的种植面积正在逐年增加。根据国际农业生物技术获取与应用协会2006年统计的数据表明：发展中国家的转基因作物种植面积及其增长率（700万公顷，21%）明显高于工业化国家（500万公顷，9%）；而且全世界在2006年转基因作物种植面积超过了1亿公顷，其中美国仍然是种植面积最大的国家，中国排名第六[2]。转基因作物不仅为各个国家的经济增长做出了巨大贡献，而且由于杀虫剂和化学农药用量的削减，在减轻环境污染方面也有着卓越的成效，英国著名经济学家Nicholas Stern爵士在《气候变化经济评价》中也指出转基因作物可以减少温室气体的排放[3]。
随着转基因技术的快速发展，转基因食品也进入了消费市场，人们可以通过转基因技术改造生物的遗传基础，使其在性状、营养品质、消费品质等方面向人类所需要的目标转变。面对越来越多的转基因食品，消费者的态度并非一致，对转基因食品的安全性问题质疑颇多。而这些安全性问题都是由传统转基因技术的瓶颈问题所决定的：第一，转入的基因除了靶基因，还有选择标记基因。而这些选择标记往往是抗生素抗性基因，这些基因进入可食部分后，对人类健康的长期影响效应仍然未知，有可能通过人体大肠内的细菌进入人体，使人体对抗生素产生抗性[4]。但是也有研究表明DNA从植物细胞中释放出来后会很快降解，不会对人体健康造成危害[5]；第二，转入的外源基因如果是抗除草剂等抗性基因，当转基因植物与杂草杂交后，使后者也具备了抗性特征，达不到改良转基因性状的目的[6]；第三，转入的外源基因由于组织培养、整合位点、转基因残余、或遗传突变等原因造成其表达不稳定[7]，可能发生基因沉默、超量表达，甚至转基因个体发生畸变，这些性状一旦遗传到后代，可能对生态环境和物种进化产生很大的影响[8]。因此，亟需研究开发出新型高效安全的转基因的方法，既能将外源基因导入到基因组的特定位点，使其稳定高效地表达，又能避免通过花粉等途径引起基因漂流，以开发转基因作物的巨大市场潜力。
为了满足市场对高产、优质、高抗优良品种的需求，目前国际上的转基因技术正在从单基因转导向多基因复合性状转基因作物转变，使获得的一个转基因个体同时具有多种优良性状，如同时抗病、抗虫、耐旱、耐盐和高产等[9]。因此，基于定点重组技术基础上的基因叠加技术应运而生[10]。基因叠加技术是在特定位点插入第一个外源基因时，同时附带一个插入位点，这样在插入第二个基因时，能迅速与前一个基因后面的插入位点识别并整合进去，依次叠加，可以获得在一个位点同时累积多个外源基因的转基因个体。特定位点的基因叠加技术不仅可以减少转基因的随机性，保证外源基因稳定高效的表达，还可以多次利用同一特定插入位点，降低插入位点对外源基因的影响，并将多个优良性状逐个逐次累加到单一个体中[11]，实现优良品种中多个外源基因的高效叠加，以缩短新品种的研发和市场化时间。
2 定点重组 (Site-specific recombination) 系统及其优点
2.1 定点重组系统简介
对于基础科学研究来说，将复杂的基因结构随机整合到植物中，只要转入的外源基因能稳定表达并遗传给后代，能够进行基因功能的研究即可。但是对于经济作物的转基因改良而言，则需要在获得的转基因植株中筛选出不仅能稳定表达，而且导入的外源基因只有一个拷贝或者接近一个拷贝的植株，以保证结构上和功能上的稳定性[11]。利用随机插入和整合的转基因技术，筛选优良株系是非常烦琐的过程，而且费时费力，转基因技术的最新突破在于通过高效定点重组反应介导外源基因在特定位点的导入或删除，并进行稳定表达和遗传[12]。
植物中已被应用的定点重组系统有3种：大肠杆菌噬菌体P1的Cre/lox[13]重组系统、酿酒酵母2μm质粒的FLP/frt[14]重组系统和接合糖酵母的pSR1质粒的R/Rs[15]重组系统。位点特异性重组系统包括重组酶和一段能被该酶识别的DNA序列。Cre/lox重组系统中的DNA识别序列大小为34 bp，非对称的间隔序列(8 bp)两侧各有一段对称的反向互补的序列(13 bp)。重组酶与该序列特异性结合，介导间隔序列处DNA双链的交换，从而发生重组。间隔序列的方向将决定两个重组位点间的间隔序列是被删除还是发生倒位[16]。
除了以上3种重组系统之外，还有两种不可逆的重组系统[17]，一是β-six和γδ-res重组系统，该重组系统具有相同的重组酶识别位点，但是只能催化DNA片断的删除，而不能催化DNA的整合，因此重组反应是不可逆的。另一种是phiC31,TP901-1,λ,Bxb1等重组系统，该重组系统最大的特点是识别两个不同的重组位点(attB和attP)，重组反应发生后产生两个与原来不同的位点attL 及attR；而重组酶不能催化新生成的位点间的重组反应，说明该重组系统介导的反应也是不可逆的。最近研究表明phiC31重组系统中的Int重组酶，除了能将外源DNA整合进靶基因组外，还能有效删除质体基因组中的标记基因[18]。由于attB和attP位点为非同源序列，phiC31重组系统介导的删除作用更稳定且不可逆。
2.2 定点重组系统的优点
定点重组技术体系的优点主要体现在以下六个方面：
（1) 特异性的外源基因整合位点。定点重组技术可以避免大量的筛选工作[19]，一旦发现某个合适的靶位点，该位点就可以被重复使用，保证导入的外源基因在目标位点插入和表达，而且受插入位点的调控序列调控[12]。这样既能避免随机插入位点对内外源基因的影响，又能更加稳定地表达外源基因。
（2) 删除标记基因。在选择标记基因两侧插入两个同向的重组酶识别位点，介入重组酶之后，删除作用发生的同时，选择标记基因也随之删除[20]，解决了转基因技术由于选择标记基因而引起的安全性问题。例如：构建含有lox位点的载体时，在特征基因和选择标记基因之间也插入一段重组位点序列，Cre重组酶通过识别相近的两个lox位点，催化重组反应，使标记基因得以删除[21]。
(3) 获得单拷贝或者接近单拷贝的外源DNA。转基因技术在导入外源基因时，常常在靶位点产生多个拷贝，而多拷贝的转基因又会导致功能和结构的不稳定[22]。通过世代杂交减少转化株中基因拷贝数的几率比较小，采用位点特异性重组系统导入外源基因则可以解决该问题。如图2所示，多拷贝转基因最远端的重组酶识别位点，在重组酶的催化作用下发生重组，最终留下一个单拷贝的转基因和一个残余的重组酶识别位点。
(4) 外源基因在不同株系中的定点易位交换(transgene translocation)。经济作物基因工程改良需要将有用的基因转化到生产栽培品种中，但是很多栽培品种的转基因体系复杂且效率低[23]。目前一般先在基因转化效率高的实验室品系中筛选出结构完整，表达良好的株系再与大田栽培品种进行多次（大约6～10次）回交，将外源基因转移至栽培品种当中。回交过程冗长且将外源基因与选择标记基因同时转移至栽培品种中，影响其生物安全性能。定点重组技术可以通过外源基因在不同株系中的定点易位交换过程，将外源基因准确高效地转移至栽培品种中[11]。在构建植物载体过程中，在外源基因两端分别加上反向loxP序列，实验室转基因株系与大田栽培品种进行杂交时，同时引入Cre重组酶。重组酶将催化染色体之间的定点重组，将实验室植株中的外源基因成功转入到栽培品种的染色体中，然后通过基因分离技术筛选出纯合的栽培品种植株，同时去除选择标记基因。
（5) 多次重复使用同一特定位点进行基因叠加(gene stacking)。目前建立的基因叠加技术利用噬菌体和细菌DNA发生重组交叉的特异位点attP和attB位点，将后续基因逐一重组到同一特定位点，再由可逆的重组系统将同时转入的非必需基因（如：选择标记基因）删除，从而达到基因叠加的效果[11]。该特点为多基因复合性状的转基因技术提供了理论依据。
（6) 特定组织器官或发育时期删除转入的外源基因。转基因作物中外源基因转化位点包括外源基因的DNA片断及两侧的重组酶识别位点。当植物发育进行到某个特定的阶段，或者在某个特定的组织器官内，重组酶可以诱导重组反应的发生，删除两个重组酶识别位点间的外源基因片断[11]。例如，在特异性发育阶段（如花粉形成时期）外源基因的删除，重组酶在花粉中特异性表达，从雄配子中删除外源DNA片断，从而避免外源基因对环境产生负面影响，提高转基因作物的生态安全性。
3 新型定点重组酶系统的探索
为了给植物遗传修饰提供更多的DNA调控工具，研究人员正在探索更多的原核生物重组系统，并在酵母和植物中进行实验检测。就重组系统介导的删除作用来说，有4种DNA删除系统：CinH，ParA，Tn1721和Tn5053，它们是小丝氨酸解离酶亚家族的成员。CinH重组系统来源于Acetinetobacter质粒pKLH2,pKLH204和pKLH205[24]。CinH重组酶有189个氨基酸，识别113 bp的RS2重组位点。ParA系统来源于质粒的操纵子parCBA [25]，其中ParA重组酶有222个氨基酸，识别133 bp的MRS(multimer resolution site)重组位点。Tn1721重组系统来源于3.8 kb的Tn1721转座子，tnpR编码的重组酶有186个氨基酸，识别120 bp的重组位点[26]。Tn5053重组系统来源于8.4 kb的Tn5053转座子，tniR编码的重组酶有204个氨基酸，识别两个176 bp的重组位点[27]。新的位点特异性重组系统不仅具有其他重组系统的基本特征，而且其重组酶的识别位点较长(113～176 bp)，大大降低了重组时与植物体内本身内源序列的重组机率；同时这些小的丝氨酸重组酶不介导整合反应，因此避免了在删除之后将DNA重新整合到植物基因组中去[17]。
最近发现了3种新的介导整合作用的重组系统： Bxb1、TP901-1和U153。Bxb1重组系统来源于Mycobacterium smegmati噬菌体Bxb1[28]，Bxb1重组酶有500个氨基酸，识别位点最小，分别为39bp和34bp的attP和attB位点。TP901-1重组系统来源于温和性噬菌体TP901-1，TP901-1重组酶有485个氨基酸，可以识别56bp和43bp的attP和attB位点[29,30]。U153重组系统来源于Listeria monocytogenes噬菌体U153，U153重组酶有452个氨基酸，可以识别57bp和51bp的attP和attB位点[31]。
4 特定位点的基因叠加 (Gene stacking) 技术及其应用前景
传统的转基因体系由于耗时长，筛选困难，不同基因间易发生分离或诱发沉默，且每次转化均需要不同的筛选标记，因而很难反复多次地对同一个体进行外源基因导入。特定位点的基因叠加技术是在定点重组技术的基础上建立起来的一种新的简化的高效安全的转基因方法。定点重组反应在特异性位点插入了目的基因，并在目的基因后端保留一个重组酶的识别位点，而基因叠加技术则利用该识别位点，将含有相应识别位点的第二个外源基因整合进去，植物体中的重组酶识别位点和外源载体中的重组酶识别位点在重组酶的作用下发生交换重组，就可以达到在特定位点进行基因叠加的效果[11]。而且每发生一次重组的同时，选择标记基因也被删除，因此进行第二次重组时，可以使用与前一次同样的选择标记基因，从而降低转基因技术中选择标记基因的负面影响。
特定位点的基因叠加技术可以多次利用同一插入位点，将多个优良性状累加到一个优良品种中，减少外源基因结构的不确定性，并保证外源基因的稳定表达，降低外源基因对基因组中其他基因的影响。同时，大大缩短了新品种的育种年限，加快转基因作物的研发进程。另外，特定位点的基因叠加技术是研究基因家族和同一代谢途径中多个基因功能的优良平台。通过将多个基因整合到同一插入位点，可以系统地比较每个基因的功能，并有效地研究基因间的拮抗和协同作用。
总之，定点重组转基因技术可谓转基因技术上的一个飞跃，不仅能将外源基因准确导入到植物基因组的特定位点，保证其高效稳定的表达，并且能够迅速将外源基因导入到优良品种中。定点重组介导的定点易位交换体系则可以在实验室和栽培品系中引入重组酶的特定识别位点，再利用其定点重组的准确性和高效性将优良的基因易位转入栽培品种，可显著缩短新品系的筛选过程并加速新品系的市场化进程。基于定点重组的基因叠加技术还可以多次重复使用同一特定位点，逐次逐个叠加多个外源基因，快速培育出复合型性状的转基因作物，不仅可以保持外源基因的结构正确性，使其在同一位点稳定表达，降低外源基因对基因组中其他基因的影响，避免基因间的分离和沉默，还可以缩短育种年限，同时基因叠加技术只使用一种选择标记基因，可以保证该技术的生物安全性，减少对生态环境的负面影响。
我国的转基因技术已经进入了国际领先水平，可是我国转基因作物的种植却并不乐观，除了人为因素之外，更多的是消费群体对转基因技术的质疑，因此，只有不断完善转基因技术，提高转基因作物的安全性，才能让转基因作物在我国普遍推广。目前对重组技术的研究还在逐步完善中，不断有新的重组系统被发现和研究，定点重组转基因技术在转基因研究中的优越性不言而喻，它不仅显著提高了转基因技术的安全性和高效性，而且还在新基因功能鉴定方面有着突出的贡献，为后基因组时代的来临奠定了坚实的基础。
参考文献 (References):
[1] Miki B. Transgene expression and control. In Vitro Cell Dev Biol-Plant, 2002, 38: 139－145.
[2] James C. Preview: Global status of commercialized biotech/GM crops: 2005. ISAAA Briefs No 34.
[3] Stern N. Economics must be at the heart of any discussion of how to fight climate change. Boston review, 2007.
[4] Kohli A, Griffiths S, Palacios N, Twyman RM, Vain P, Laurie DA, Christou P. Molecular characterization of transforming plasmid rearrangements in transgenic rice reveals a recombination hotspot in the CaMV 35S promoter and confirms the predominance of microhomology mediated recombination. Plant J, 1999, 17: 591－601.
[5] Chowdhury EH, Kuribara H, Hino A, Sultana P, Mikami O, Shimada N, Guruge NS, Saito M, Nakajima Y. Detection of corn intrinsic and recombinant DNA fragments and Cryl Ab protein in the gastrointestinal contents of pigs fed genetically modified corn Btll. J Anim Sci, 2003, 81: 2546－2551.
[6] Jia S, Wang F, Shi L, Yuan Q, Liu W, Liao Y, Li S, Jin W, Peng H. Transgene flow to hybrid rice and its male-sterile lines. Transgenic Res, 2007, 16: 491－501.
[7] Ow DW. Recombinase-directed plant transformation for the post-genomic era. Plant Mol Biol, 2002, 48: 183-200.
[8] Babinger P, Kobl I, Mages W, Schmitt R. A link between DNA methylation and epigenetic silencing in transgenic Volvox carteri. Nucleic Acids Res, 2001, 29: 1261－1271.
[9] Bennett J. Status of breeding for tolerance of abiotic stresses and prospects for use of molecular techniques. 2001. In: Applications of molecular biology and genomics to genetic enhancement of crop tolerance to abiotic stress. Food and agriculture organization of the United Nations. 2003. (http://www.fao.org/wairdocs/TAC/Y5198E/y5198e00.HTM)
[10] Halpin C. Gene stacking in transgenic plants-the challenge for 21st century plant biotechnology. Plant Biotechnol J, 2005, 3: 141-155.
[11] Ow DW. 2004 SIVB congress symposium proceeding: Transgene management via multiple site-specific recombination systems. In Vitro Cell Dev Biol-Plant, 2005, 41: 213－219.
[12] Srivastava V, Ariza-Nieto M, Wilson AJ. Cre-mediated site-specific gene integration for consistent transgene expression in rice. Plant Biotechnol J, 2004, 2: 169－179.
[13] Sauer B, Henderson N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85: 5166-5170.
[14] Golic KG, Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell, 1989, 59: 499－509.
[15] Onouchi H, Yokoi K, Machida C, Matsuzaki H, Oshima Y, Matsuoka K, Nakamura K, Machida Y. Operation of an efficient site-specific recombination system of Zygosaccharomyces rouxii in tobacco cells. Nucleic Acids Res, 1991, 19: 6373－6378.
[16] Vergunst AC, Jansen LE, Fransz PF, Jong H, Hooykaas PJ. Cre/lox-mediated recombination in Arabidopsis: evidence for transmission of a translocation and a deletion event. Chromosoma, 2000, 109: 287－297.
[17] Thomson JG, Ow DW. Site-specific recombination systems for the genetic manipulation of eukaryotic genomes. Genesis, 2006, 44: 465－476.
[18] Kittiwongwattana C, Lutz K, Clark M, Maliga P. Plastid marker gene excision by the phiC31 phage site-specific recombinase. Plant Mol Biol, 2007, 64: 137－143.
[19] Day CD, Lee E, Kobayashi J, Holappa LD, Albert H, Ow DW. Transgene integration into the same chromosome location can produce alleles that express at a predictable level, or alleles that are differentially silenced. Genes Dev, 2000, 14: 2869－2880.
[20] Dale EC, Ow DW. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88: 10558－10562.
[21] Puchta H. Marker-free transgenic plants. Plant Cell Tissue Organ Cult, 2003, 74: 123－133.
[22] Srivastava V, Ow DW. Single-copy primary transformants of maize obtained through the co-introduction of a recombinase-expressing construct. Plant Mol Biol, 2001, 46: 561－566.
[23] Ow DW. GM maize from site-specific recombination technology, what next? Curr Opin biotechnol, 2007, 18: 115-120.
[24] Kholodii GY. The shuffling function of resolvases. Gene, 2001, 269: 121-130.
[25] Gerlitz M, Hrabak O, Schwab H. Partitioning of broad-host-range plasmid RP4 is a complex system involving site-specific recombination. J Bacteriol, 1990, 172: 6194－6203.
[26] Rogowsky P, Schmitt R. Tn1721-encoded resolvase: Structure of the tnpR gene and its in vitro functions. Mol Gen Genet, 1985, 200: 176－181.
[27] Kholodii GY, Mindlin SZ, Bass IA, Yurieva OV, Minakhina SV, Nikiforov VG. Four genes, two ends, and a res region are involved in transposition of Tn5053: A paradigm for a novel family of transposons carrying either a mer operon or an integron. Mol Microbiol, 1995, 17: 1189－1200.
[28] Mediavilla J, Jain S, Kriakov J, Ford ME, Duda RL, Jacobs WR Jr, Hendrix RW, Hatfull GF. Genome organization and characterization of mycobacteriophage Bxb1. Mol Microbiol, 2000, 38: 955－970.
[29] Christiansen B, Brondsted L, Vogensen FK, Hammer K. A resolvase-like protein is required for the site-specific integration of the temperate lactococcal bacteriophage TP901-1. J Bacteriol, 1996, 178: 5164－5173.
[30] Breuner A, Brondsted L, Hammer K. Resolvase-like recombination performed by the TP901-1 integrase. Microbiology, 2001, 147: 2051-2063.
[31] Lauer P, Chow MY, Loessner MJ, Portnoy DA, Calendar R. Construction, characterization, and use of two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors. J Bacteriol, 2002, 184: 4177－4186.
2007年9月7日
